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          肺腺癌骨轉移癌痛患者外周血轉錄組學研究

          學術期刊發表網 位置:醫學論文 時間:2021-01-06 09:42 (12)

          摘要:摘 要: 目的 研究肺腺癌骨轉移癌痛(metastatic bone pain,MBP)患者外周血轉錄組學以闡釋其發生發展中的關鍵基因和通路。方法 選擇我院呼吸內科肺腺癌骨轉移住院患者11例,其中5例患者符合

            摘 要:

            目的 研究肺腺癌骨轉移癌痛(metastatic bone pain,MBP)患者外周血轉錄組學以闡釋其發生發展中的關鍵基因和通路。方法 選擇我院呼吸內科肺腺癌骨轉移住院患者11例,其中5例患者符合典型骨轉移癌痛表現且疼痛視覺模擬評分≥4分(MBP組),6例視覺模擬評分為0分(C組)。收集兩組患者外周血進行轉錄組測序,利用R語言篩選差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs)并進行生物學功能富集分析。對DEGs進行蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡分析,獲得最顯著蛋白表達模塊及關鍵基因,并結合TCGA臨床數據對關鍵模塊內基因進行生存分析。結果 共獲得差異基因共2 332個,其中上調基因1 647個,下調基因685個。GO和KEGG結果顯示,DEGs主要富集在趨化因子轉導通路和p53信號轉導通路上。通過PPI網絡分析及生存分析,篩選出4個關鍵節點基因(CXCL1、CXCL10、CXCR4和GNG7),其中GNG7與肺腺癌患者生存率密切相關。結論 趨化因子/趨化因子受體CXCL1、CXCL10、CXCR4與GNG7可能作為MBP的重要預測因子和治療靶點,為臨床治療提供依據。

            關鍵詞:肺腺癌 骨轉移癌痛 RNA-seq 生物信息學

          肺腺癌骨轉移癌痛患者外周血轉錄組學研究

            肺癌骨轉移好發于脊柱和軀干骨近端,約50%肺癌骨轉移患者可出現骨癌痛,且隨著病情逐漸加重,嚴重影響患者情緒、睡眠和日常生活能力[1]。骨轉移癌痛(metastatic bone pain,MBP)作為一種難治性癌痛,包括靜息時持續性疼痛、靜息時自發或運動時誘發的爆發痛。盡管目前已有雙磷酸鹽、核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)的單克隆抗體等骨改良藥物的廣泛應用,但是骨轉移癌痛的發生率仍居高不下,其原因是發生發展機制尚未完全闡明。目前,針對骨轉移癌痛的機制研究多集中于動物模型,而行為學實驗難以全面、準確評估骨轉移癌痛的疼痛特點。RNA-seq技術是利用第二代高通量測序技術對轉錄組進行研究的方法,能夠針對特定組織或細胞的所有差異表達基因、基因變異等進行研究,從而識別與疾病發生發展密切相關的核心基因。該技術在肺癌的分子病因學研究中取得了一系列的成果[2],然而針對肺癌骨轉移癌痛的研究較少。本研究擬通過選擇典型肺腺癌骨轉移癌痛患者,利用RNA-seq技術篩選與骨轉移癌痛發生發展密切相關的關鍵基因,并采用生物信息學方法對其進行生物功能和生存分析研究,為臨床治療骨轉移癌痛提供理論依據。

            1 資料與方法

            1.1 一般資料

            本研究經中山大學附屬第一醫院倫理委員會批準,并與患者簽署知情同意書。選擇我院2019年8月至2020年3月肺腺癌骨轉移患者11例,其中符合典型骨轉移癌痛臨床表現且疼痛視覺模擬評分(VAS)≥4分者作為骨轉移癌痛組(MBP組,n=5),VAS評分為0分者作為對照組(C組,n=6)。本研究中典型骨轉移癌痛患者臨床表現需滿足靜息時持續性疼痛、靜息時自發性爆發痛或運動時誘發性的爆發痛,且病程大于1個月。納入標準:年滿18歲;組織學或細胞學明確診斷為肺腺癌者;脊柱部位骨病變活檢為肺癌轉移/具備典型的骨轉移影像學表現者,即局限病灶需MRI/PET-CT/骨組織活檢確診,廣泛病灶需PET-CT/CT/X線/MR確診。排除標準:近1個月內對腫瘤部位或疼痛部位使用放射治療者,非癌性痛或非骨轉移部位引起疼痛者,明顯肝腎功能不全者,合并急/慢性感染性疾病,不能準確描述疼痛部位及進行疼痛評分者。每位受檢者用PAXgene管抽取外周血5 m L,于-80℃冰箱中保存。

            1.2 RNA提取、文庫構建及測序

            采用1%瓊脂糖凝膠進行RNA降解和污染監測。利用Agilent4200TapeStation(Agilent technologies,CA,美國)系統檢測RNA完整性,采用帶有Oligo(dT)的磁珠對具有polyA結構的m RNA進行捕獲并形成1stcDNA,再進行PCR擴增,純化擴增產物:包括DNA片段化處理、末端修復、加堿基A、加接頭以及PCR擴增和文庫質控等,最終建成文庫。接著對文庫進行Illumina PE150測序,根據Illumina HiSeqTM2500平臺測序獲得原始數據(raw reads),經過去除低質量序列、去接頭污染等數據過濾過程得到高質量的序列(clean reads)。利用RPKM(reads per kilobaseof exon model per million mapped reads)值衡量基因的表達量。1.3 R DEseq2[3]

            1.3 差異表達基因篩選

            使用R軟件DEseq2[3]包對上述RNA-seq數據進行標準化并篩選差異表達基因(differentially expressed gene,DEGs)。本研究中如基因符合以下標準,則該基因被認為是DEGs:DEseq2中的錯誤發現率(false discovery rate,FDR)<0.05;log2差異倍數(fold change,FC)<-1或log2 FC>1。使用ggplot2軟件包在R軟件中繪制火山圖。

            1.4 通路與功能富集分析

            將DEGs導入DAVID在線分析網站進行GO(geneontology,GO)和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)功能富集分析,分析其中涉及骨轉移癌痛的相關通路,以P.adjust<0.05為閾值篩選差異表達基因的富集分析結果。

            1.5 蛋白相互作用網絡分析

            將DEGs導入STRING在線分析網站進行蛋白質互相作用網絡分析(protein-protein interaction,PPI)。利用Cytoscape軟件對上述PPI結果進行可視化,并使用插件MCODE篩選出關鍵蛋白表達模塊及與骨轉移癌痛密切相關的基因,設置參數:Degree≥6,K-core≥2,Node Score Cutoff≥0.2及Max.Depth=100作為篩選標準。

            1.6 生存分析

            將關鍵蛋白表達模塊內的基因導入GEPIA工具[4],根據TCGA數據庫中肺腺癌患者臨床隨訪信息,包括生存狀態和總生存時間和,繪制Kaplan-Meier生存曲線,并進行log-rank統計檢驗;計算風險比(hazard ratio,HR),分析關鍵節點基因的預后關系,P<0.05認為差異有統計學意義。

            2 結果

            2.1 差異表達基因的篩選

            對比兩組基因表達差異,基于標準(|log FC|>1 and P<0.05),找到2332個DEGs,其中上調基因1647個,下調基因685個。并利用ggplot2軟件包在R中繪制火山圖(圖1)。

            2.2 差異基因的通路與功能富集分析

            將DEGs導入DAVID數據庫中進行GO功能分析與KEGG通路富集分析,并按照P值從小到大展示前十位的GO條目(表1、圖2)及所有的KEGG富集通路(表2、圖3)。結果顯示差異基因主要功能富集表達于趨化因子信號傳導、p53信號通路、ECM受體相互作用等通路。

            表1 前10的GO富集分析結果

            表2 KEGG通路富集分析結果

            2.3 蛋白互作網絡分析及關鍵基因篩選

            將差異表達基因導入STRING在線分析網站進行蛋白互作網絡分析,利用Cytoscape軟件的MCODE插件對結果進行可視化分析并篩選出PPI網絡中重點蛋白表達模塊,設置參數:Degree≥6,Node Score Cutoff≥0.2,K-core≥2及Max.Depth=100作為篩選標準,得到1個與骨轉移癌痛密切相關的蛋白表達模塊及4個關鍵基因(圖4)。

            圖2 GO富集分析結果

            2.4 生存分析

            為了探究模塊內20個關鍵節點基因與肺腺癌的預后關系,利用TCGA隨訪數據結合關鍵節點基因表達值進行生存分析,分析結果發現與GNG7高表達患者相比,肺腺癌患者中低表達GNG7患者生存率明顯降低(P<0.05)。見圖5。

            3 討論

            肺癌的發病率及死亡率居全國首位,其發生骨轉移的概率高達10%~15%,腺癌是其中最常見的病理類型[5],骨轉移癌痛是癌癥中晚期患者經常面臨的十分重要的問題,嚴重影響這類患者的生存質量。傳統動物實驗主要通過脛骨或股骨注入肺腫瘤細胞獲得骨轉移癌痛模型,不足以反映肺癌骨轉移癌痛患者疼痛的發生發展機制。

            本研究發現在肺腺癌骨轉移癌痛患者外周血細胞中CXCL1、CXCL10、CXCR4基因表達顯著上調。同時,在GO和KEGG功能富集分析中也發現了眾多基因在趨化因子信號傳導等炎性通路上顯著富集。既往研究表明,CXCL1和CXCL 10可誘發骨轉移癌痛大鼠痛覺過敏,使用受體拮抗劑或中和抗體抑制趨化因子信號通路,能夠有效減輕疼痛程度[6]。另外有證據表明趨化因子表達上調可以減弱阿片類藥物的鎮痛作用,大鼠脊髓鞘內注射CXCL 10可減弱嗎啡的鎮痛作用[7],這可能為治療癌性爆發痛提供新思路。CXCR4是CXCL12的主要受體,多表達于脊髓神經元和膠質細胞[8]。SHEN等[8]研究顯示骨轉移癌痛大鼠脊髓組織中CXCL12和CXCR4表達水平升高,并且可以通過致敏神經元、激活星形膠質細胞和小膠質細胞促進骨轉移癌痛的發展。近期研究進一步明確了脊髓神經元中的CXCR4可以通過下游Ca MKII/CREB通路誘導骨轉移癌痛大鼠痛覺敏化[9]。綜上所述,CXCL1、CXCL10和CXCR4可能參與了肺癌骨轉移灶腫瘤微環境的形成,并且可能通過誘導中樞敏化促進癌性爆發痛發生,這些都為骨轉移癌痛的臨床治療提供理論依據。

            進一步對關鍵蛋白表達模塊內的20個基因進行生存分析,結果表明低表達GNG7的肺腺癌患者生存率明顯降低(P<0.05)。文獻報道,GNG7(G蛋白γ7亞基)廣泛表達于各種組織,但在多種腫瘤細胞如胰腺癌、胃癌、食管癌等細胞中低表達[10]。GNG7既可以通過抑制m TOR通路介導的細胞自噬和凋亡,也可以通過調節肌動蛋白細胞骨架抑制細胞分裂[10],提示骨轉移癌痛的發生可能與GNG7的抗腫瘤作用減弱有關。另外,非癌性痛患者中GNG7也顯示出與疼痛發生的明顯相關性。NICULESCU等[11]研究提示GNG7可能作為一種疼痛抑制基因,在阿爾茲海默癥并重度疼痛狀態患者的血液中明顯低表達。同時,作者通過長期隨訪進一步證實GNG7是阿爾茲海默癥患者發生重度疼痛的強預測因子[11]。另有證據表明疼痛相關疾病如糖尿病周圍神經病變及椎間盤突出患者中也出現了GNG7基因的明顯差異表達[12-13]?;谝陨涎芯?,推測GNG7作為抑癌基因延緩肺腺癌骨轉移的發生發展。同時,GNG7與多種疼痛疾病的發生密切相關,可能成為骨轉移癌痛發生的重要預測因子。

            本研究差異基因功能富集分析結果顯示趨化因子信號通路和p53信號轉導通路在兩組患者出現表達差異,再次表明趨化因子的高表達與骨轉移癌痛發生關系密切。P53信號通路是多種腫瘤發生中最常見的突變通路,在前列腺癌小鼠模型中,P53突變細胞群體對骨的親和力更高,容易誘導成骨細胞的形成而發生骨轉移[14]。文獻報道,晚期肺癌表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)敏感突變患者易攜帶P53基因產生共突變,該亞克隆共突變事件促進腫瘤的轉移并極大地影響EGFR-TKI的療效[15-16]。而骨轉移患者肺原發灶與骨轉移灶EGFR和P53共突變高度一致[15],表明EGFR和P53共突變可能是驅動肺癌細胞發生骨轉移的起始基因。另外,體外肺癌細胞實驗證明,功能獲得性P53基因表達能夠促進EGFR信號通路的表達,而EGFR的表達又可以反式激活P53[17]。因此,P53和EGFR的共突變可能是驅動肺癌細胞骨轉移的關鍵。

            本研究不足之處在于尚未對肺腺癌患者的個體差異和疾病特質性進行分類,且未對疼痛程度進行分層分析,同時沒有開展細胞或動物實驗驗證上述結論,后期將進一步探討。

            綜上所述,本研究通過轉錄組學相關方法,證明趨化因子/趨化因子受體CXCL1、CXCL10、CX-CR4與GNG7參與了骨轉移癌痛的形成,其中趨化因子信號傳導通路和p53信號通路可能是肺腺癌骨轉移癌痛發生的重要機制,為臨床治療肺腺癌骨轉移疼痛提供了重要預測因子和治療靶點。

            參考文獻

            [1]董智,趙軍,柳晨,等.肺癌骨轉移診療專家共識(2019版)[J].中國肺癌雜志,2019,22(4):187-207.

            [2]SHUKLA S,EVANS J R,MALIK R,et al.Development of a RNA-Seq based prognostic signature in lung adenocarcinoma[J].J Natl Cancer Inst,2017,109(1):1-9.

            [3]FAN W,LU N,SHEN Z,et al.Generic synthesis of smallsized hollow mesoporous organosilica nanoparticles for oxygen-independent X-ray-activated synergistic therapy[J].Nat Commun,2019,10(1):1241.

            作者:林中原;王益敏;張輝;林世清;劉德成

            相關期刊推薦:《實用醫學雜志》是由廣東省衛生健康委員會主管、廣東省醫學學術交流中心(廣東省醫學情報研究所)主辦的全國性綜合性醫學學術類期刊,創刊于1972年,目前為半月刊。


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